De bloei van Leiden ging langzaam over in een tijd van stagnatie en verval. Bovendien waren het onrustige tijden. Godsdienstige, sociale en politieke tegenstellingen tekenden de 16e eeuw. Alleen de kunst floreerde.

Vanaf het einde van de 15e eeuw kreeg de lakennijverheid het steeds moeilijker. In 1494 raakte de stad zelfs in een faillissement. De bevolking verarmde en kromp. Nergens waren zoveel bedelaars als in Leiden. Daarbij maakten diverse pestepidemieën, de grootste in 1509, vele slachtoffers.
Opvallend genoeg bloeide de kunst als nooit tevoren, vooral de schilderkunst. De bekendste schilder uit die tijd, Lucas van Leyden, was ver buiten Holland beroemd.

Hervorming
Op religieus gebied was het de tijd van de Hervorming. Er werd steeds meer getwijfeld aan de katholieke leerstellingen. Daarnaast groeide de weerstand tegen de tentoonspreiding van rijkdom van de kerk. Nieuwe protestantse stromingen kwamen op, en werden hard vervolgd.